科研动态 | 魏东芝团队继国际首创生物法精草铵膦大规模产业化，酶与生物催化力作发表于Angew

2023-04-17

手性胺是众多生物医药以及精细化工的重要组成砌块。ω-转氨酶以其底物谱广和严格的立体选择性等优点成为了酶法不对称合成手性胺的潜在生物催化剂之一。但是，受限于ω-转氨酶活性中心几何结构的限制，其对于非天然底物分子尤其是大位阻的底物分子催化效率低下，这严重阻碍了ω-转氨酶不对称合成手性胺的工业化应用进程。近日，华东理工大学鲁华生物技术研究所魏东芝团队以具有复杂催化步骤的ω-转氨酶为研究对象，通过量化手段揭示该酶催化过程中对于模式底物催化低效性的关键因素和共性问题，再联合Rosetta酶设计手段基于限速过渡态对酶活性中心进行多位点协同设计。该策略不仅简化了酶设计过程中基于多个中间体和过渡态设计的复杂性，而且降低了由此产生和积累的突变体库的数量，最终实现对ω-转氨酶催化活力提升的高效理性设计。相关研究成果发表于化工领域国际顶级期刊《Angewandte Chemie International Edition》：Mechanism-Guided Computational Design of ω-Transaminase by Reprograming of High-Energy-Barrier Steps。（&nbsp;https://doi.org/10.1002/anie.202212555）。这是该团队继国际首创5千吨/年生物法精草铵膦生产技术产业化后，发表的有关酶与生物催化技术与方法学力作。研究概述目前，基于蛋白质工程的定向进化以及理性设计手段改造ω-转氨酶是提升酶催化效率的主要手段，这些手段大部分是利用对酶-底物在活性中心的静态前反应构象进行分析，并且取得了一系列重要的成果。但是，ω-转氨酶的催化机制非常复杂的，通常包括多个化学步骤，涉及多个过渡态及中间体，并伴随着能量的动态变化以及底物构象中的波动（图1）。基于静态底物构象指导的酶设计可能在局部反应状态下保持最佳构象，但是，这些状态很容易被破坏，且当切换到另外一个反应状态时可能并不适用，这将导致常规ω-转氨酶改造策略效率低下。为了提高酶设计高效性，必须同时考虑整个催化过程中的多个底物状态并且对其进行精确识别。但这不仅急剧增加了突变库容量，而且使酶设计变得复杂，从而导致成功率低下。因此，具有复杂催化机制生物催化剂的酶设计仍然是一个较大的挑战。<img src="http://www.biocatsyn.cn/webfile/upload/2023/04-27/21-08-260087-1924946582.png" title="文章4.png" alt="文章4.png"/>图1 ω-转氨酶脱氨反应催化机理。 魏东芝教授团队长期从事生物催化及合成生物学领域研究。在本论文中，研究者以ω-转氨酶CC1012为研究对象，首先通过对该酶进行蛋白质结晶获取精确的结构信息（图2b），再利用QM量化手段对其脱氨反应催化机理进行解析（图2d-2e），最终获得ω-转氨酶对于(S)-2a脱氨过程详细催化机理（图1）以及催化过程中能量和酶-底物动态变化过程（图3）。<img src="http://www.biocatsyn.cn/webfile/upload/2023/04-27/21-09-390177-2128903460.png" title="文章4-1.png" alt="文章4-1.png" width="680" height="423" style="width: 680px; height: 423px;"/>图2 ω-转氨酶不对称合成手性胺中间体以及晶体结构解析。<img src="http://www.biocatsyn.cn/webfile/upload/2023/04-27/21-10-320403-1083289815.png" title="文章4-2.png" alt="文章4-2.png" width="680" height="696" style="width: 680px; height: 696px;"/> 图3 ω-转氨酶脱氨过程中能量动态变化以及关键催化构象变化。 基于上述对高能垒催化步骤的共性特征的总结，选择催化机制中的限速步骤且具有最高能量的TS4作为设计对象(图4a)。利用Rosetta酶设计程序对底物(S)-2a在活性中心4 Å范围内对底物结合起关键作用的氨基酸残基(图4b)进行虚拟突变，共设计产生了一个具有40,000个虚拟突变体库。以Rosetta能量函数评估约束的惩罚分数以及和底物与活性位点之间的亲和力分数作为筛选标准。选择了排名靠前的14个突变设计，用于进一步的实验表征(图4c)。结果显示，这14个设计的突变体均表现出显着提高的催化活性，相对于野生型的CC1012增加了16.9-142.8倍活力提高(图4d)，突变体M9(Q25F/M60W/W64F/I266A)显示出相对于最高的细胞还原胺化催化活性，其中M9在24 h内获得了最高的转化率，达到了78 %，与此同时，通过测定WT和M9的动力学参数以进一步比较分析突变体对催化效率的影响，突变体M9对芳基烷基类底物1a的kcat/Km相对于野生型WT提高了1660倍。<img src="http://www.biocatsyn.cn/webfile/upload/2023/04-27/21-11-060768-1296545613.png" title="文章4-3.png" alt="文章4-3.png" width="680" height="465" style="width: 680px; height: 465px;"/>图4 计算辅助重塑CC1012设计用于底物1a的还原胺化。研究总结该论文成功地提高了ω-转氨酶的催化效率。研究者通过量化手段阐明了ω-转氨酶对于目标底物的催化机制，并精确地确定了ω-转氨酶催化过程中每个反应状态中每个反应状态中的过渡和基态。此外，通过研究三个高能催化步骤之间的分子相互作用揭示了该酶低催化效率的共性特征，并用于指导随后的酶设计。利用量化+Rosetta酶设计策略，仅需构建了一个小的突变库，就能高效筛选出催化效率提高的突变体。该策略不仅减轻了在酶设计过程中同时考虑多个反应状态的设计难度，而且还显着降低了基于催化过程中每个反应状态的酶设计中积累的突变库的容量。该策略不仅显著提高了ω-转氨酶对于模式底物的催化效率，而且还证明了该策略应用于理性设计ω-转氨酶的高效性和准确性，为后续改进以及发掘更多的ω-转氨酶理性改造策略提供了理论基础。